植物与生物组织稳定同位素分析送样指南

Q: 植物/动物组织采集后为什么要尽快冷冻并干燥？

组织在空气中放置会发生腐解，难以预测地改变 δ¹³C、δ¹⁵N 与 C:N（改变方向随组织类型而异），损害结果可比性。采集后应冰上暂存并当天转 −20 ℃ 冷冻，并尽快干燥（植物组织 50–60 ℃ 烘 24–48 小时至恒重，或冷冻干燥），避免长时间常温放置与反复冻融。注意植物水 δ²H、δ¹⁸O 是例外：水本身即分析对象，须冷藏鲜样送检，切勿烘干或风干。

Q: 动物组织高脂要不要做脂类处理？为什么植物不能用 C:N 归一化？

动物组织与植物组织的处理方式不同。脂类相对蛋白质、碳水化合物明显贫 ¹³C，组织间脂含量差异会系统性压低 δ¹³C、干扰食性/营养级解读。常用两法：①化学脂类提取；②基于 C:N 比的数学归一化——该式的依据限于水生动物（在陆生动物上，C:N 与 δ¹³C 偏移之间的回归并不显著，原文 P = 0.069），在水生动物上两法校正 δ¹³C 效果总体相当（差异随物种/组织而异）。注意化学提取可能改变部分样品 δ¹⁵N，故采用化学提取时建议 δ¹⁵N 用未提取样测定。若委托时一并要求报告 C%、N%，据以计算的 C:N 可直接用于动物组织的归一化。植物样则不同：提出该方法的原始研究明确指出，植物一般同样应做脂类提取或归一化，但预测量必须改用 C% 而非 C:N——植物在氮素吸收与分配上有可塑性，C:N 与脂含量之间不存在稳定关系，套用动物的 C:N 阈值无效。

Q: 植物/组织样一般送多少？为什么 δ¹⁵N 送样量更大？

植物组织 δ¹³C/δ¹⁵N 一般 ≥0.5 g 干样（低氮组织加量），全硫 δ³⁴S 需 ≥2 g 干样且硫总量 ≥5 mg（两者取大）。组织中氮含量通常低于碳，低氮的木质化茎/干所需样量大于富蛋白的动物组织，故 δ¹⁵N 所需样量通常大于 δ¹³C。样品须研磨为均匀细粉（一般过 100 目）以保证代表性。纯陆生植物/动物软组织通常无需酸化；若含碳酸盐才去除，且 δ¹³C 用酸化样、δ¹⁵N 用未酸化样分测。

植物与生物组织的碳氮同位素（δ¹³C、δ¹⁵N）是研究食物网营养级结构、碳氮循环、光合途径与水分利用效率的经典指标。这类样品结果对采后保鲜、干燥方式与是否需要脂类处理较为敏感。本文汇总核素科技实验室对植物组织、动物/生物组织及全硫（δ³⁴S）等项目的送样要求，并说明面向研究设计的前处理原理。

本实验室送样要求

项目	最小送样量	样品状态	关键要求
植物组织 δ¹³C、δ¹⁵N（叶/茎/根/种子）	≥0.5 g 干样（低氮组织建议加量）	洗净后 50–60 ℃ 烘 24–48 小时或冷冻干燥、研磨过筛	去除附着土壤与表面污染；根系需充分洗净
动物/生物组织 δ¹³C、δ¹⁵N（食物网）	视组织而定，一般干样 ≥0.5 g	采后冰上暂存并当天转 −20 ℃ 冷冻，优先冷冻干燥；避免反复冻融	高脂组织需评估脂类处理方案（见下）
植物水／木质部水 δ²H、δ¹⁸O（抽提后测定）	每株用生长锥（约 0.5 cm）在胸高处取 2–3 根约 5 cm 的边材木芯，同一株的木芯装入同一支 12 mL 气密玻璃瓶后立即密封（每株一支）	⚠️ 鲜样冷藏，切勿烘干、切勿风干	水本身即分析对象：取边材、避开心材，用刀刮去外层与内层树皮，但务必保留最外侧年轮的组织（这一点最容易做错）；采后立即装瓶、瓶盖旋紧后以 Parafilm 缠封（防蒸发靠密封），置约 4 ℃ 冷藏并尽快寄送——野外与运输阶段不要冷冻，冷藏是为抑制蒸发失水与分馏、微生物生长及有机质分解；实验室以低温真空抽提出液态水后测定
全硫 δ³⁴S（植物/组织）	≥2 g 干样，且硫总量 ≥5 mg（两者取大）	50–60 ℃ 烘干或冻干、研磨过 100 目	不酸化；植物含硫多在 0.1–0.5%，采样阶段即须按干重估算；生物基质全硫 δ³⁴S 需个案确认可行性，请送样前与实验室核算

⚠️ 最容易毁样的一步——先分清你要测的是"组织"还是"组织里的水"：δ¹³C、δ¹⁵N、δ³⁴S 测的是干燥后的组织，必须烘干或冻干；而植物水（主要为茎／木质部水）δ²H、δ¹⁸O 测的是组织中的液态水，一经烘干或风干，分析对象即全部损失、无法补救。两类指标都要测时，请在采样现场就分成两份：一份装气密瓶密封冷藏（勿冷冻）尽快寄送测植物水，另一份按下文干燥流程处理测碳氮硫。

通用说明：植物组织在强制通风烘箱中 50–60 ℃ 烘 24–48 小时至恒重（厚组织、种子适当延长），或冷冻干燥；动物／生物组织可用冷冻干燥或同温区烘干——文献对两者是否等效尚无一致结论：有研究认为二者可互换，也有实测报告干燥方式的影响显著，但两个指标很不一样：δ¹⁵N 在所测 6 个物种上全部显著（烘干样略偏正），而 δ¹³C 仅模型主效应显著、逐物种比较中 6 个里只有 1 个显著。正因如此，关键不在于选哪一种，而在于同一研究内的全部样品必须用同一种干燥方式与同一温度，并在方法部分写明。各实验室送样规程的口径并不统一：多数实验室并不公布具体温度，只要求样品"完全干燥"；公布温度的那些集中在 50–80 ℃、多在 50–60 ℃ 区间，其中 60 ℃ 是被提及最多的单一温度，时长多为 24–48 小时；本页给出的 50–60 ℃ 烘 24–48 小时取自其中一家实验室的规程（见参考文献），可作缺省方案。真正要避免的是测含水率用的"105 ℃ 烘至恒重"那类高温流程。需注意 35 ℃±5 ℃、≤40 ℃ 这类低温上限是土壤样前处理的要求（HJ 166—2026 第 8.2.2.2 条"烘干"：烘干温度应不影响目标物测定，"一般温度控制在35℃±5℃"，并规定"分析方法有明确规定时，按分析方法执行"；ISO 11464:2006 对土壤风干与烘干均要求不超过 40 ℃），不适用于植物与生物组织——该温度下植物组织干燥过慢、易霉变腐解。干燥后研磨至均匀细粉（一般过 100 目），装入密封袋或样品瓶，清晰标注编号并附样品信息表。同一份样品即可用于 δ¹³C 与 δ¹⁵N 测定（两项按服务项目分别委托）；碳、氮含量（C%、N%，据以计算 C:N）由独立的元素分析仪（Elementar Unicube）另行测定，可按需一并委托并随报告提供（请在委托时说明），便于食物网与养分研究。若目标指标含量偏低、基质特殊或涉及血液/尿液等特殊生物基质，请送样前与实验室沟通确认取样量与前处理方案。

请勿自行添加任何保存剂或防腐剂：福尔马林（甲醛）固定会改变组织 δ¹³C：一部分甲醛的碳被并入组织，故 δ¹³C 会朝所用福尔马林自身的 δ¹³C 方向移动，但这并非唯一机理——固定过程还伴随可观的干重损失。实测 δ¹³C 偏移多为偏负，量级随类群与生境而变（淡水浮游动物约 −0.2～−0.4‰，海洋浮游动物保存 1 年及以上均值约 −1.4‰，底栖类群可达约 −2～−3‰）。关键在于：这一偏移在保存约 1–2 年内形成后即趋于稳定，之后长达十余年不再显著累积——所以老标本并不比放了一两年的标本更糟，但也不会因为"放久了就稳定了"而变得可用。幅度随基质、保存时长与所比对的对照处理而变，无法事后用统一系数回改；相对而言 δ¹⁵N 受到的影响小得多（浮游动物约 +0.25～+0.4‰，统计上显著但量级极小；底栖类群不显著）——福尔马林不含氮，这与上述"碳被并入"的机理一致；乙醇浸泡会同时改变 δ¹³C 与 δ¹⁵N。在以液氮急冻为对照的实测比较中，冰上暂存是唯一未产生显著偏移的保存方式，而乙醇组的偏移量（以绝对值计）δ¹³C 约 0.42‰、δ¹⁵N 约 0.56‰，且效应的幅度与显著性因物种而异，无法用统一系数回改。长期冷冻本身的影响该研究列为待研究项，因此请按上方"通用说明"的时限尽快送检。已有的福尔马林或乙醇馆藏标本仍可承接，但请在委托时明确注明保存方式，结果只可在同一保存方式内部相互比较。

采后处理与前处理原理（面向研究设计）

以下为同位素生态学中的通用机理，具体到某一项目的最优前处理请以与实验室确认为准。

采后尽快保鲜与干燥：组织在空气中放置发生腐解，会难以预测地改变 δ¹³C、δ¹⁵N 与 C:N（改变方向随组织类型而异），影响结果的可比性。采集后应冰上暂存（当天内）并尽快转 −20 ℃ 冷冻，随后尽快干燥（详见上方通用说明），避免长时间常温放置。鲜样冷冻保存建议控制在数周内送检，并避免反复冻融——在海洋动物组织上的实测表明，反复冻融对 δ¹³C、δ¹⁵N 无一致方向的影响（个别物种例外），但会使组织 %C、%N 总体下降；若你的研究同时用到碳氮含量或 C:N，这一项就会受影响（该研究的实测对象不含植物组织，从谨慎出发植物样同样建议避免）。
脂类对 δ¹³C 的系统性影响（以下 C:N 归一化的依据限水生动物）：脂类相对蛋白质、碳水化合物明显贫 ¹³C（δ¹³C 更负），动物与水生生物组织间的脂含量差异会系统性地压低 δ¹³C 并干扰食性/营养级解读。常用两种处理：①化学脂类提取，②基于 C:N 比的数学归一化——该归一化式的依据限于水生动物：在水生生物中 C:N 与脂含量、与脂类造成的 δ¹³C 偏移都关系密切，而在陆生动物上，C:N 与 δ¹³C 偏移之间的那条回归并不显著（原文 Table 1 式(6)：R² = 0.250、P = 0.069、n = 14；需说明原文正文另有 28% 与 33% 两处表述，三个数字互不相容，此处取与 P 值、样本量自洽的 0.250）。注意失效的只是这一条——C:N 与脂含量本身的关系在陆生动物上依然很强。在水生动物上，两法对校正 δ¹³C 的效果总体相当（具体差异随物种与组织而异）；因此对陆生动物样，本实验室建议采用化学提取而非 C:N 归一化。（原文的相关建议是：遇到该研究未充分覆盖的类群或组织，应先用化学提取，配对测出"去脂前后 δ¹³C 差值"与 C:N 的关系，用该类群自己的关系去校正，而不是直接套用通用式。）需注意化学脂类提取可能改变部分样品的 δ¹⁵N，故若采用化学提取，建议 δ¹⁵N 使用未提取的样品测定。若委托时一并要求报告 C%、N%，据以计算的 C:N 可直接用于归一化判断。
⚠️ 植物样也要考虑脂类，但预测量必须换成 C%，不能用 C:N：提出该方法的原始研究明确给出两点结论—— 植物样一般同样应做脂类提取或数学归一化（即便脂含量很低），但在植物中 C:N 并不能预测脂含量、也不能预测脂类造成的 δ¹³C 偏移，应改用 C%。文中把原因归于植物在氮素吸收与分配上的可塑性——氮含量可独立于脂类而大幅变动，于是 C:N 与脂含量之间根本不存在稳定关系（数值上植物 C:N 普遍远高于动物组织：该研究给出的动物判据为水生动物 C:N < 3.5、陆生动物 C:N 约 4，均为质量比）。因此请不要把动物组织的 C:N 阈值套到植物样上：这既不是有效的判据，也不是"不用校正"的理由。实操上，若需要对植物 δ¹³C 做脂类校正，请在委托时一并要求报告 C%并采用基于 C% 的归一化式；该研究还指出，C% 偏低（低于约 40%）的材料如海洋藻类或海草，C% 与 δ¹³C 偏移之间同样没有可用关系；对这类材料以及高脂的种子、果实等，本实验室建议直接采用化学脂类提取。
怎么"洗净"：快速冲洗，不要浸泡：叶面附着的粉尘、土壤颗粒与气溶胶会带入外源碳、氮、硫，其中沿海地区的海盐硫酸盐（ss-SO₄²⁻）由海水直接夹带而来，δ³⁴S 因而接近现代海水硫酸盐的约 +21‰。需要洗净的理由不在于这个值偏离多少——表面附着的硫酸盐本就不是植物代谢的硫，它会把全硫 δ³⁴S 拉向气溶胶端元，混淆你想解读的植物自身硫源信号；对元素含量的影响同理。推荐做法：采后用去离子水快速冲洗并立即用洁净滤纸吸干；沾附土壤颗粒较多时可用软毛刷辅助。切勿长时间浸泡或揉搓——会淋失细胞内可溶性组分（可溶糖、硝酸盐、可溶硫），反而改变 δ¹³C、δ¹⁵N 与 δ³⁴S。若研究目标本身就是叶面沉降物，则不应清洗，请在委托时明确说明。动物与水生生物的肌肉等内部组织不需要这一步——它们没有叶面沉降问题，冲洗反而会淋失可溶性含氮组分。
酸化仅在含碳酸盐时使用，且与 δ¹⁵N 分开：纯陆生植物与动物软组织通常无需酸化；若样品含碳酸盐（钙化结构、贝壳、或混入的土壤碳酸盐），碳酸盐会使 δ¹³C 偏正，测有机质 δ¹³C 前需去除；而酸化本身会改变 δ¹⁵N 并伴随可溶性氮与有机质的溶脱（对初级生产者尤为明显），也不适用于 δ³⁴S。因此规范做法是 δ¹³C 用酸化样、δ¹⁵N 用未酸化样分别测定，酸化时用量宜少、不额外漂洗。能用物理方法剔除钙化结构的应优先物理去除。
氮是限制因素、需充分均质：组织中氮含量通常低于碳，低氮的植物组织（如木质化的茎、干）所需样量大于富蛋白的动物组织；样品须研磨为均匀细粉以保证取样代表性，δ¹⁵N 所需样量通常大于 δ¹³C。另需注意研磨器具材质：木质化茎干、纤维素类样品在塑料球磨管中研磨时，器具磨损会污染 δ¹³C。有研究以钢磨球在聚丙烯管中做多因子实验（2/3 颗磨球 × 10/40 mg 样量 × 5/10 分钟），结果低样量（10 mg）组污染最重：δ¹³C 偏移约 −1.34‰，经纤维素提取后累积至约 −3.38‰；δ¹⁸O 不受影响。但其结论是无条件的：原文写明球磨管内制样可用于氧同位素分析、不可用于碳同位素分析，并指出仍需要一种快速、简便且无污染的制样流程——不要理解成"加大样量就能安全地用塑料管测 δ¹³C"。因此测 δ¹³C 的样品请勿在塑料研磨管或研磨罐中制样，宜用玛瑙研钵、不锈钢或氧化锆罐并缩短研磨时间。
食物网研究要保持前处理一致：同一研究内不同营养级、不同物种的样品应采用一致的干燥、脂类与酸化处理，否则各样品的 δ¹³C、δ¹⁵N 之间不可比，会传导为营养级与混合模型的偏差。

参考文献

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Silberberger M.J., Koziorowska-Makuch K., Kuliński K., Kędra M. (2021) Stable Isotope Mixing Models Are Biased by the Choice of Sample Preservation and Pre-treatment: Implications for Studies of Aquatic Food Webs. Frontiers in Marine Science 7:621978.（支持福尔马林保存使 δ¹³C 向所用福尔马林自身的 δ¹³C 偏移。注意该文并未自行比较烘干与冻干——它把两者的等效性当作前提假设并转引他人研究；其自身比较的是烘干与冷冻保存，结论是冷冻保存存在偏倚） https://doi.org/10.3389/fmars.2020.621978
Lehmann M.M., Geris J., van Meerveld I. 等（共 70 位作者，2025）Soil and tree stem xylem water isotope data from two pan-European sampling campaigns. Earth System Science Data 17:6129-6147.（COST Action CA19120 两次泛欧洲联合采样的数据集论文，其附件为统一的野外与实验室取样规程。支持植物水取样的边材取样与"刮去树皮但保留最外侧年轮"、约 4 ℃ 冷藏且野外阶段不冷冻，以及低温真空抽提流程） https://doi.org/10.5194/essd-17-6129-2025
Rees C.E., Jenkins W.J., Monster J. (1978) The sulphur isotopic composition of ocean water sulphate. Geochimica et Cosmochimica Acta 42(4):377-381.（GEOSECS 站位样品加 1 个太平洋表层样，现代海水硫酸盐 δ³⁴S 均值 +20.99‰，为海盐气溶胶硫端元约 +21‰ 的出处） https://doi.org/10.1016/0016-7037(78)90268-5
Northern Arizona University, Arizona Climate and Ecosystems (ACE) Isotope Laboratory — Stable Isotope Sample Submission Instructions.（该实验室送样规程原文："Drying of plants, animals, and soils can be accomplished via a drying oven at 50–60°C for 24–48 h, or via a freeze drier"，并要求送样前烘至恒重。实验室规程，非同行评议文献） https://in.nau.edu/aceisotopelab/stable-isotope-analytical-services/stable-isotope-sample-submission-instructions/
Bessey C., Vanderklift M.A. (2014) Drying method has no substantial effect on δ¹⁵N or δ¹³C values of muscle tissue from teleost fishes. Rapid Communications in Mass Spectrometry 28(3):265-273.（标题即结论：烘干与冻干对鱼类肌肉 δ¹⁵N、δ¹³C 无实质影响。为"有研究认为二者可互换"一侧的一手出处。需注意其比较的是烘箱／食品干燥机／冻干三法，δ¹⁵N 差异统计上显著但不超过 0.21‰，故原文用词是"无实质影响"而非"无差异"；样本为 3 种硬骨鱼肌肉） https://doi.org/10.1002/rcm.6780
Rennie M.D., Ozersky T., Evans D.O. (2012) Effects of formalin preservation on invertebrate stable isotope values over decadal time scales. Canadian Journal of Zoology 90(11):1320-1327.（含文献汇总分析。为海洋浮游动物福尔马林保存 1 年以上 δ¹³C 约 −1.4‰、2–11 年约 −2.2‰、淡水浮游动物约 −0.4‰ 的出处） https://doi.org/10.1139/z2012-101
Isaac-Renton M., Schneider L., Treydte K. (2016) Contamination risk of stable isotope samples during milling. Rapid Communications in Mass Spectrometry 30(13):1513-1522.（支持塑料研磨器具对 δ¹³C 的污染：低样量（10 mg）实测偏移约 −1.34‰，经纤维素提取后累积至约 −3.38‰；纯聚丙烯自身 δ¹³C 偏离对照 −6.77‰、PTFE 滤袋纤维偏离 −5.02‰，二者均为污染端元、不是样品偏移；δ¹⁸O 不受影响。其结论句为球磨制样可用于氧同位素、不可用于碳同位素分析，且未对样量设置放宽条件。实测的球磨管只有聚丙烯一种、磨球为钢质；该文 Discussion 附带提及"或许更耐磨的 PTFE 管"，但该句带 possibly、无任何实验支持，其 Table 5 脚注也只为陶瓷与金属容器背书，故不可据以认为 PTFE 可安全替代。本站据作者自存的开放获取全文核对） https://doi.org/10.1002/rcm.7585
李蕾, 汪旭明, Rudi Schäufele, 蔡炳贵, 巩晓颖 (2021) 聚四氟乙烯塑料管研磨法对测定C4植物碳同位素比值的影响. 应用生态学报 32(6):1963-1970.（以不锈钢管为对照的实测。支持 PTFE 球磨管的颗粒污染使同一 C4 植物（糙隐子草）不同重复间 Δ¹³C 出现约 4.8‰ 的组间差值、单个叶片 δ¹³C 误差高达 8‰；其建议为对精度要求较高的研究改用不锈钢研磨器具。注意 4.8‰ 是 Δ¹³C 的组间差值，不是 δ¹³C 的偏移量） https://www.cjae.net/CN/10.13287/j.1001-9332.202106.019

常见问题

植物/动物组织采集后为什么要尽快冷冻并干燥？